เอกสารประชุมวิชาการระดับขาติมหาวิทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 28 2561

941 งานวิจัยและนวัตกรรมเพื่อสังคมที่มั่นคง มั่งคั่ง และยั่งยืน (Research and Innovation for Social Stability, Prosperity and Sustainability) Escherichia coli ATCC25922 และ Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 และยีสต์ 3 สายพันธุ์ คือ Candida albicans ATCC90028 C. albicans NCPF3153 และ Cryptococcus neoformans ATCC90112 สาหรับแบคทีเรีย streak เชื้อแบคทีเรียทดสอบลงบนอาหาร nutrient agar (NA) จากนั้นนาไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง จะสังเกตเห็นโคโลนีของแบคทีเรียขċ้นบนจานอาหาร จากนั้นทาการเตรียมเชื้อ เริ่มต้นโดยเขี่ยแบคทีเรีย 3-5 โคโลนี ลงในอาหาร nutrient broth (NB) ปรับความขุ่นของเชื้อด้วยน้าเกลือ 0.85 เปอร์เซ็นต์ ที่ปราศจากเชื้อ ให้ได้ 0.5 McFarland standard ( เชื้อประมาณ 1.5×10 8 CFU/ml) และเจือจางต่อที่อัตราส่วน 1:200 ด้วยอาหาร Mueller-Hinton Broth (MHB) สาหรับยีสต์ streak เชื้อยีสต์ทดสอบลงบนอาหาร sabouraud’s dextrose agar (SDA) จากนั้นนาไปบ่มที่ อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียสสาหรับ C. albicans และบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสสาหรับ C. neoformans เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จะสังเกตเห็นโคโลนีของยีสต์ขċ้นบนจานอาหาร จากนั้นทาการเตรียมเชื้อเริ่มต้นโดยเขี่ยยีสต์ 3-5 โคโลนี ลงใน อาหาร sabouraud’s dextrose broth (SDB) ปรับความขุ่นของเชื้อด้วยน้าเกลือ 0.85 เปอร์เซ็นต์ ที่ปราศจากเชื้อ ให้ได้ 2 McFarland standard และเจือจางต่อที่อัตราส่วน 1:20 ด้วยอาหาร SDB 4. การทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ของสารสกัดด้วยวิธี colorimetric broth microdilutiontests 4.1 ทดสอบฤทธิ์เบČ้องต้นของสารสกัดทีęความเข้มข้น 600 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร นาสารสกัดหยาบที่เตรียมไว้ที่ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ดูดใส่ใน sterile 96-well microtiter plates หลุมละ 12 ไมโครลิตร จากนั้นดูดอาหาร MHB สาหรับแบคทีเรีย และดูดอาหาร SDB สาหรับยีสต์ ลงไปหลุมละ 88 ไมโครลิตร และดูดเชื้อทดสอบที่เตรียมไว้ซċ่งปรับความขุ่นแล้วใส่ใน sterile 96-well microtiter plates ที่มีสารสกัด และอาหารอยู่ หลุมละ 100 ไมโครลิตร โดยทาการทดสอบ 3 ซ้า จากนั้นนาไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 ชั่วโมง สาหรับแบคทีเรีย และยีสต์ C. albicans และบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 ชั่วโมงสาหรับ C. neoformans หยด resazurin indicater (0.18%) ลงในหลุมทดสอบหลุมละ 30 ไมโครลิตร และนาไปบ่มต่อเป็นเวลา 2- 3 ชั่วโมง เมื่อครบเวลาที่กาหนดอ่านผลการทดสอบโดยสังเกตสีของ resazurin หากยังคงเห็นเป็นสีน้าเงินให้ผลเป็นบวก แสดงว่าสารสกัดสามารถยับยั้งการเติบโตของเชื้อทดสอบได้ และหากเปลี่ยนเป็นสีชมพูให้ผลเป็นลบแสดงว่าสารสกัดไม่ สามารถยับยั้งการเติบโตของเชื้อทดสอบได้ 4.2 การหาค่าความเข้มข้นตęาสุดของสารสกัดทีęสามารëยับยั้งเชČ้อทดสอบ The minimum inhibitory concentrations; MICs) และการหาค่าความเข้มขั้นตęาสุดของสารสกัดทีęสามารëÛ่าเชČ้อทดสอบ The minimum bactericidal concentration; MBCs หรČอ minimum fungicidal concentration; MFC) การหาค่า MIC นาสารสกัดที่ให้ผลการยับยั้งเชื้อทดสอบที่ความเข้มข้น 600 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร มาทดสอบ หาค่า MIC ในช่วงความเข้มข้น 512 – 1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร โดยการดูดอาหารเหลว MHB สาหรับแบคทีเรีย และ อาหารเหลว SDB สาหรับยีสต์ ใส่ลงใน sterile 96-well microtiter plates หลุมละ 89 ไมโครลิตร แล้วดูดสารสกัดหยาบ ใส่ sterile 96-well microtiter plates หลุมเดียวกันกับอาหารเหลวอยู่ หลุมละ 11 ไมโครลิตร แล้วทาการเจือจางแบบ 2-fold dilution เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของสารสกัดหยาบอยู่ในช่วง 512-1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร แล้วดูดอาหารและสาร สกัดที่ความเข้มข้นสุดท้ายทิ้ง 50 ไมโครลิตร โดยทดสอบความเข้มข้นละ 3 ซ้า จากนั้นดูดเชื้อทดสอบที่มีอัตราส่วน 1:200 สาหรับแบคทีเรีย และเชื้อที่มีอัตราส่วน 1:20 สาหรับยีสต์ ที่เตรียมไว้ใส่ใน sterile 96-well microtiter plates หลุมละ 50 ไมโครลิตร นาไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 ชั่วโมง สาหรับแบคทีเรีย และยีสต์ C. albicans และ บ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 ชั่วโมง สาหรับ C. neoformans จากนั้นหยด resazurin indicater (0.18 เปอร์เซ็นต์ ) ลงในหลุมทดสอบหลุมละ 30 ไมโครลิตร และนาไปบ่มต่อที่ 35 องศาเซลเซียส สาหรับแบคทีเรีย และยีสต์ C. albicans และ 25 องศาเซลเซียส สาหรับ C. neoformans เป็นเวลา 3 ชั่วโมง เมื่อครบเวลาที่กาหนดอ่านผลการทดสอบ บันทċกค่าความเข้มข้นต่าสุดที่สามารถยับยั้งเชื้อทดสอบได้เป็นค่า MIC การหาค่า MBC หรČอ MFC นาผลที่ระดับความเข้มข้นต่าสุดที่สามารถยับยั้งเชื้อได้ในการทดสอบ MIC มา streak บนอาหาร NA สาหรับแบคทีเรีย และ streak บนอาหาร SDA สาหรับยีสต์ จากนั้นนาจานอาหารไปบ่มที่สภาวะ เดียวกับการทดสอบข้างต้น อ่านค่าความเข้มข้นต่าสุดที่สามารถÛ่าเชื้อแบคทีเรียได้เป็นค่า MBC และอ่านค่าความเข้มข้น ต่าสุดที่สามารถÛ่าเชื้อยีสต์ได้เป็นค่า MFC