เอกสารประชุมวิชาการระดับขาติมหาวิทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 28 2561

942 การประชุมวิชาการระดับชาติมหาวิทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 28 ประจ�าปี 2561 5. การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งอนุมูลอิสระ โดยวิธี , diphenyl – 1- picrylhydrazyl radical scavenging activity (DPPH) 5.1 การศċกþาฤทธิ์การกาจัดอนุมูลอิสระ DPPH เบČ้องต้น ทีęความเข้มข้น 5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร นาสารสกัดหยาบที่เตรียมไว้ที่ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ที่ละลายใน DMSO ดูดใส่ใน sterile 96- well microtiter plates ปริมาตร 50 ไมโครลิตร และเติมสารละลาย DPPH ความเข้มข้น 1 มิลลิโมล่าร์ ปริมาตร 50 ไมโครลิตร จากนั้นนาไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 517 นา โนเมตร โดยใช้วิตามินซี ascorbic acid เป็นตัวควบคุมเชิงบวก positive control) และใช้ DMSO เป็นตัวควบคุมเชิง ลบ negative control) คานวณหาค่าเปอร์เซ็นต์การออกฤทธิ์ยับยั้งอนุมูลอิสระ และค่า EC 50 ของการกาจัดอนุมูลอิสระ DPPH โดยใช้สูตรดังนี้ % radical scavenging activity = [A 0 A 1 -A 2 )/A 0 ] × 100 เมื่อ A 0 คือ Blank A 1 คือ ค่าการดูดกลืนแสงของปäิกิริยาที่มีสารสกัด A 2 คือ negative control 6. การทดสอบการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส การศċกษาฤทธิ์การยับยั้งแอลฟากลูโคซิเดส โดยเตรียมตัวอย่างของสารสกัดที่ความเข้มข้น 5 มิลลิกรัมต่อ มิลลิลิตร ละลายสารตัวอย่างใน dimethyl sulfoxide DMSO ปริมาตร 10 ไมโครลิตร สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ความเข้มข้น 0.1 โมล่าร์ ที่ pH 6.9 ปริมาตร 50 ไมโครลิตร เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส ความเข้มข้น 0.1 ยูนิต ปริมาตร 40 ไมโครลิตร จากนั้นบ่มปäิกิริยาเบื้องต้นเป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส จากนั้นเติม p -Nitrophenyl-  - % -glucopyranosidease PNPG ความเข้มข้น 1 มิลลิโมล่าร์ ปริมาตร 50 ไมโครลิตร แล้วบ่มปäิกิริยาเป็นเวลา 20 นาที ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เมื่อครบเวลาให้หยุดกิจกรรมของแอฟากลูโคซิเดส โดยใช้โซเดียมคาร์บอเนต Na 2 CO 3 ความเข้มข้น 1 โมล่าร์ ปริมาตร 100 ไมโครลิตร หลังจากนั้นตรวจติดตามปริมาณของ p -Nitrophenol ที่เกิดขċ้นโดยวัด การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น นาโนเมตร โดยใช้ยาอะคาโบส acarbose เป็นตัวควบคุมเชิงบวก จากนั้น คานวณ เปอร์เซ็นต์การยับยั้งแอลฟากลูโคซิเดสและค่า IC 50 ของสารสกัดในการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสเช่นเดียวกับการ ทดสอบการกาจัดอนุมูลอิสระ 7. การตรวจสอบหาสารพฤกþเคมีเบČ้องต้นของสารสกัดหยาบด้วยวิธีมาตรฐาน [2-3] 7.1 การตรวจสอบหาสารðระกอบฟŘนอลิก (phenolic compound) เตรียมสารสกัดหยาบของแต่ละตัวทาละลายที่ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ละลายใน DMSO ดูดสาร สกัด 100 ไมโคลิตร ผสมกับ 7.5 เปอร์เซ็นต์ น้าหนักต่อปริมาตร ) Na 2 CO 3 ปริมาตร 400 ไมโครลิตร และเติม 10 เปอร์เซ็นต์ น้าหนักต่อปริมาตร ) folin-ciocalteu reagent ปริมาตร 500 ไมโครลิตร จากนั้นเขย่าและตั้งสารผสมไว้ที่ อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง สังเกตการเปลี่ยนแปลงสีของสารผสม โดยเปรียบเทียบกับสารมาตรåาน หากปรากäสีน้า เงินแสดงว่ามีสารประกอบฟีนอลิก 7.2 การตรวจสอบหาสารกลุ่มซาโðนิน saponin) ชั่งสารสกัด 0.01 กรัม เติมน้ากลั่น 250 ไมโครลิตร ต้มให้เดือด จากนั้นเติมน้ากลั่น 150 ไมโครลิตร เขย่าหากมี ฟองเกิดขċ้นแสดงว่าพบซาโปนิน 7.3 การตรวจสอบหาสารกลุ่มแทนนิน tannin) ชั่งสารสกัด 0.01 กรัม เติมน้ากลั่น 250 ไมโครลิตร นาไปอุ่นใน water bath หยดสารละลาย FeCl 3 2 หยด ลง ไป หากปรากäสีเขียวดาหรือน้าเงินดาแสดงว่าพบแทนนิน 7.4 การตรวจสอบหาสารกลุ่มอัลคาลอยด์ alkaloid) ชั่งสารสกัด 0.01 กรัม ละลายด้วยสารละลาย 2 เปอร์เซ็นต์ H 2 SO 4 700 ไมโครลิตร นาไปอุ่นเป็นเวลา 3 นาที จากนั้นหยดน้ายาดราเจนดอร์ฟ dragendorff’s reagent หากปรากäตะกอนสีส้มแดงแสดงว่าพบสารอัลคาลอยด์