Proceeding2562

1560 การประชุมวิชาการระดับชาติมหาวิทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 29 ประจ�ำปี 2562 วิจัยและนวัตกรรมเพื่อการพัฒนาที่ยั่งยืน วิธีดําเนินการ ตัวอยางที่ใชในการวิจัย ตัวอยางชีวภาพในการศึกษาครั้งนี้เปนตัวอยางดีเอ็นเอที่เหลือจากโครงการ การตรวจวิเคราะหความผิดปกติในระดับ โมเลกุลและรูปแบบแฮพโพลไทปยีนโกลบินของฮีโมโกลบินผิดปกติในภาคเหนือของประเทศไทย คณะสหเวชศาสตร มหาวิทยาลัย พะเยา ซึ่งสกัดดวยวิธี phenol-chloroform และทราบชนิดแลวจากการตรวจดวยวิธี ASPCR (โครงการนี้ไดผานการรับรองจาก คณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในมนุษย มหาวิทยาลัยพะเยา เลขที่โครงการ 2/083/59) ตัวอยางเหลานี้ถูกใชเพื่อหาสภาวะที่ เหมาะสมสําหรับเทคนิค PCR-HRM และสําหรับการศึกษาความสอดคลองของ 2 เทคนิค ใชตัวอยางที่ปกปดผลการตรวจ (Blind sample) โดยทั้งหมดตรวจยืนยันฮีโมโกลบินดวยวิธี ASPCR จํานวน 97 ราย เพื่อใหในการเปรียบเทียบกับวิธี PCR-HRM ไดแก ตัวอยางคนปกติ (Normal or negative for Hb Hope and Hb Tak) จํานวน 17 ตัวอยาง, ตัวอยาง Heterozygous Hb Hope จํานวน 71 ตัวอยาง, ตัวอยาง Heterozygous Hb Tak จํานวน 9 ตัวอยาง วิธีการวิจัย สําหรับการตรวจหาฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดออกแบบไพรเมอร 1 คู ไดแก F-Hope กับ R Hopeในการเพิ่มจํานวนดีเอ็น เอบริเวณ Exon 3 ของยีนเบตาโกลบิน ครอบคลุมตําแหนงการกลายพันธของ Hb Hope และ Hb Tak ขนาด 170 bp ดังรูปที่ 1 หลังจากนั้นนําตัวอยางดีเอ็นเอคนปกติและดีเอ็นเอที่ทราบชนิดการกลายพันธุแลวมาใชศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมสําหรับปฏิกิริยา เพิ่มจํานวนดีเอ็นเอ (PCR) และเทคนิค HRM ดวยเครื่อง real time-PCR Light Cycler 480 (Roche Diagnostic, Germany) สวนประกอบของปฏิกิริยาเพิ่มจํานวนดีเอ็นเอ (PCR) ปริมาตรทั้งหมด 20 ไมโครลิตร ประกอบดวย ไพรเมอร F-Hope, R-Hope, Eva green HRM mix (Solis BioDyne, Estonia) และ 20 ng DNA สําหรับขั้นตอนปฏิกิริยาเพิ่มจํานวนดีเอ็นเอประกอบดวย 95 ๐ C เปนเวลา 15 นาที และเพิ่มจํานวนดีเอ็นเออุณหภูมิ 95 ๐ C 30 วินาที, 56 ๐ C 20 วินาที และ 72 ๐ C 20 วินาที ตามลําดับ จํานวน 30 รอบ ตอดวยขั้นตอน HRM ที่ 95 ๐ C 45 วินาที 55 ๐ C 45 วินาที จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิ จาก 55 ๐ C ถึง 95 ๐ C เพื่อ ตรวจหาอุณหภูมิที่แยกจากสายคูของ DNA ออกเปนสายเดี่ยวได และทําการวิเคราะห HRM profiles ผาน Light Cycler software package ของเครื่อง Light Cycler 480 ซึ่งเครื่องจะติดตามสัญญาณ fluorescence ที่ลดลง เมื่อมีการเพิ่มอุณหภูมิ จะทําใหดีเอ็นเอสายคูแยกเปนสายเดี่ยว ทําใหสัญญาณ fluorescence ลดลงซึ่งแตละ PCR product จะมีสัญญาณ fluorescence ลดลงแตกตางกันขึ้นอยูกับคา Tm ของแตละ PCR-productและจะวิเคราะหผลเปนกราฟรูปแบบเฉพาะ (different plot) โดย Light Cycler software (Roche Diagnostic, Germany) การวิเคราะหผลการวิจัย การคํานวณหา % ความสอดคลองของวิธี ASPCR และ PCR-HRM โดยใชสูตรการคํานวณดังนี้ % ความสอดคลอง = จํานวนผลการตรวจวิเคราะหที่ใหผลตรงกัน จํานวนตัวอยางที่วิเคราะหทั้งหมด รูปที่ 1 แสดงตําแหนงไฟรเมอรใชในการตรวจ Hb Hope และ Hb Tak ประกอบดวย primer 1 คู ครอบคลุม Exon 3 ของยีนเบตาโกลบิน ที่มีตําแหนง mutation ที่ทําใหเกิด Hb Hope และ Hb Tak ขนาดของ PCR product 170 bp