full2012.pdf - page 1133

3
รวมทั้งตรวจวัดประสิทธิภาพการย อยสลายสีคริ สตัลไวโอเลตและสีมาลาไคธกรีน ของแบคทีเรียที่คัดแยกออกมาได เพื่อ
เปนแนวทางในการศึกษาเกี่ยวกับการใชวิธีทางชีวภาพสํ าหรับฟนฟูสภาพแวดลอมตอไป
วิธี การวิจั ย
การคัดแยกแบคทีเรี ยที่มีความสามารถในการยอยสลายสีคริสตัลไวโอเลตและสีมาลาไคธกรีน
ใชไมพันสําลีป ายตะกอนจากอางย อมสีในหองปฏิบัติการจุลชีววิทยาฯ ใสลงในหลอดทดลองฝาเกลี ยว ที่มี 0.85%
NaCl ปริมาตร 2 มิลลิลิตร แลวนําไปเขยาเพื่ อใหตะกอนหลุดออกจากไมพั นสําลี จากนั้นนําสารแขวนลอยไปกระจาย
เชื้อ บนอาหารเลี้ ยงเชื้อแข็ง Luria-Bertani Crystal violet (LCV) ที่มีสีคริ สตัลไวโอเลต (500 มิลลิ กรัมตอลิตร) หรือ
อาหารเลี้ ยงเชื้อแข็ง Luria-Bertani Malachite green (LMG) ที่มีสีมาลาไคธกรีน (500 มิลลิ กรัมตอลิตร) จากนั้นนําจาน
เพาะเชื้อไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ชั่วโมง คัดแยกโคโลนีเดี่ ยวไปเพาะเลี้ยงในขั้นตอนตอไป
ความสามารถของแบคทีเรียในการย อยสลายสีคริสตัลไวโอเลตและสีมาลาไคธกรี น
นํ าแบคทีเรียที่คัดแยกไดจากขั้นตอนกอนหนา ไปเพาะเลี้ยงอีกครั้งบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง LCV ที่มีสีคริ สตัลไวโอ-
เลต (500 มิลลิกรัมตอลิตร) หรืออาหารเลี้ยงเชื้ อแข็ง LMG ที่มีสีมาลาไคธกรีน (500 มิลลิกรัมตอลิตร) บมที่ 37 องศา-
เซลเซียส เปนเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อคัดเลือกแบคทีเรียที่มีความสามารถในการย อยสลายสีคริ สตัลไวโอเลตและสีมาลา-
ไคธกรีน โดยวัดขนาดเสนผานศูนยกลางของโซน จากนั้นคัดเลือกโคโลนีที่ใหขนาดวงใสสูงสุดไปทําการศึกษาตอใน
ขั้นตอไป
ความสามารถของแบคทีเรียในการทนตอสีคริสตัลไวโอเลตและสี มาลาไคธกรีน
แยกนําแบคทีเรียที่คัดเลื อกจากขั้นตอนกอนหนานี้ ไปเลียงในอาหารเลี้ยงเชื้ อเหลว LB หรือ Nutient broth (NB)
ปริมาตร 5 มิลลิลิตร โดยใส 1 โคโลนี ตอหลอด แลวนํ าไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเปนเวลา 24 ชั่วโมงแบบ
สภาวะเขยา (ความเร็ว 150 รอบตอนาที) จากนั้นนําหวงถายเชื้อถายเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ ง LCV หรืออาหารเลี้ยง
เชื้อแข็ ง LMG ที่มีระดั บความเขมขนของสียอม 500, 1,000, 5,000, 10,000, 15,000 และ 20,000 มิ ลลิกรัมตอลิตร แลว
นํ าไปบมเพาะเชื้อที่สภาวะเดิม คัดแยกโคโลนี เชื้อที่มีความสามารถในการทนตอสีคริ สตัลไวโอเลตหรื อสีมาลาไคธกรี น
ที่ความเข มขนสูงสุดไปทําการศึกษาขั้นตอไป
ประสิทธิภาพในการยอยสลายสีคริสตัลไวโอเลตและมาลาไคธกรี นที่สภาวะเขย า
นํ าแบคทีเรียที่ คัดแยกไดจากขั้นตอนกอนหนานี้ ไปปรับความขุนของเชื้อเทียบเท า McFarland No. 0.5 มิลลิลิตร
จากนั้ นนําสารแขวนลอยเชื้อปริมาตร 1 มิ ลลิ ลิตร ถายใสลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว LCV ที่ มีสีคริสตัลไวโอเลต และ
อาหารเลี้ยงเชื้อ LMG ที่มีสี มาลาไคธกรีน เข มขน 500 มิลลิกรัมตอลิ ตร ปริมาตร 100 มิลลิ ลิตร ในขวดรูปชมพูขนาด
บรรจุ 250 มิลลิลิตร บมเลี้ ยงเชื้อที่สภาวะเขยา (ความเร็ว 150 รอบต อนาที) ที่ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แลวเก็ บ
ตัวอยางทุกๆ 24 ชั่วโมง เปนเวลา 5 วัน โดยนํ าตัวอยางไปป นเหวี่ยงที่ความเร็ ว 10,000 รอบตอนาที เปนเวลา 20 นาที
แลวนําสวนใสของสารละลายมาวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 590 นาโนเมตรสํ าหรับ CV และที่ความยาวคลื่ น
618 นาโนเมตรสําหรับ MG โดยใชอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไมไดใส เชื้อเปนชุดควบคุมการทดลอง
คํานวณความเขมขนของสีคริสตั ลไวโอเลตและสีมาลาไคธกรีน ที่ เวลาตางๆ เปรี ยบเทียบกับกราฟมาตรฐาน ที่ มี
ความสั มพันธกับคาการดูดกลืนแสงของสีนั้นๆ พรอมทั้งคํานวณเปอรเซ็นการลดลงของสี จากสูตร
เปอรเซ็ นการลดลงของสี = [(ความเขมข นเริ่มต น – ความเขมขนที่วัดได) / ความเขมขนเริ่มตน] × 100
1133
การประชุมวิชาการระดับชาติ มหาวิ ทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 22 ประจำปี 2555