3
µ¦¦³»
¤ª·
µµ¦Â¨³Á°¨µª·
´
¥¤®µª·
¥µ¨´
¥´
¬·
¦´Ê
¸É
19
¦³Î
µe
2552
°»
¦r
¨³ª·
¸
µ¦
µ¦´
Á°Å¤r
ŨÁµÁºÊ
°¤³¡¦o
µª
Î
µµ¦´
ÁºÊ
°¤³¡¦o
µªo
ª¥µ¦¨³¨µ¥´
¢Á¢°¦r
50 mM Sodium acetate ¡¸
Á° 4 -6 50 mM Tris-base
¡¸
Á° 7-9 Ã¥´
Ä°´
¦µn
ª
°ÁºÊ
°¤³¡¦o
µªn
°µ¦¨³¨µ¥´
¢Á¢°¦r
Á}
1:1(w/v) µ¦´
¸É
Åo
Î
µ¤µ¦°Â¨³
Î
µÅÁ¦·
¢d
ªr
¸É
ªµ¤Á¦È
ª 8,000 rpm Á}
Áª¨µ 15 µ¸
Â¥Á°µÁ¡µ³µ¦¨³¨µ¥´Ê
ÊÎ
µÂ¨o
ªÎ
µÅÁ¦·
¢d
ªr
°¸
¦´
Ê
¸É
ªµ¤Á¦È
ª 10,000 rpm Á}
Áª¨µ 15 µ¸
Â¥µ¦¨³¨µ¥´Ê
ÊÎ
µÄ¸É
Åo
ÁÈ
¸É
°»
®£¼
¤·
4
o
C
µ¦Â¥Á°Å¤r
ŨÁo
ª¥¦³µ¦¨³¨µ¥ÊÎ
µ°ª´
£µ
µ¦Â¥Á°Å¤r
ŨÁµ¤³¡¦o
µªÃ¥Äo
¦³µ¦¨³¨µ¥ÊÎ
µ°ª´
£µ
Ã¥Äo
5% 10 % 15% ¨³
20%
° Polyethylene glycol 1500
´
笼
° Tripotassium citrate Î
µµ¦´
Á°Å¤r
¤µ¤´
Polyethylene
glycol 1500 µ¤Á°¦r
ÁÈ
¸É
Î
µ® ¨³¨µ¥Ä®o
Á
o
µ´
¸É
°»
®£¼
¤·
4
o
C µ´Ê
Á·
¤Á¨º
° Tripotassium citrate ¸É
¨³o
°¥
Ç ¨Ä
°¤´
¨n
µª¸É
¤¸
µ¦¨°Áª¨µ
°¤Â¥ 2 ´Ê
Ã¥´Ê
Á}
´Ê
PEG ´Ê
¨n
µÁ}
´Ê
°
µ¦¨³¨µ¥Á¨º
° Å®µn
µ °·
ª·
¸Ê
°Á°Å¤r
ŨÁ¦·
¤µÃ¦¸
¨³«¹
¬µ»
¤´
·
°Á°Å¤r
n
°Å
µ¦®µn
µÂ°·
ª·
¸Ê
°Á°Å¤r
ŨÁ
n
µÂ°·
ª·
¸Ê
°Á°Å¤r
ŨÁ (modified Kilcawley
et al
. 2002) Î
µÅo
Ã¥Î
µ´
ª°¥n
µ 200 ôl Á·
¤¨Ä
0.1 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 2.45 ml ¸É
¦³°o
ª¥ 0.15 M NaCl ¨³ 0.5% Triton X-100 ¸É
n
µµ¦°»n
¸É
40 ºC Á}
Áª¨µ 5 µ¸
¨o
ª Á·
¤ 50 mM
p
-nitrophenylpalmitate(¸É
¨³¨µ¥Ä Acetonitrile) 200 ôl ¨o
ªÎ
µÅn
¤¸É
°»
®£¼
¤·
40 ºC Á}
Áª¨µ 30 µ¸
Î
µÅª´
n
µµ¦¼
¨º
¸É
410 nm Î
µn
µµ¦¼
¨º
¸É
Åo
Á¸
¥´
¦µ¢
¤µ¦µ
°
p
-nitrophenol ¸É
n
ªªµ¤Á
o
¤
o
0.0 - 0.1 ôg Ã¥Î
µ®Ä®o
1 ®n
ª¥
°Á°Å¤r
ŨÁ®¤µ¥¹
¦·
¤µÁ°Å¤r
¸É
Á¦n
·
·
¦·
¥µµ¦¥n
°¥
p
-nitrophenylpalmitate Įo
Åo
p
-nitrophenol 1 ômol n
°µ¸
£µ¥Äo
£µª³¸É
Î
µ®
µ¦®µ¦·
¤µÃ¦¸
¨³µ¦Â¥Ã¦¸
o
ª¥Á·
ÃÁ¸
¥¤ÃÁ·
¨´
¨Á¢ ᨷ
°³¦·
¨µÅ¤r
Á¨ °·
Á¨Ã¦Ã¢¦·
·
(SDS-PAGE)
µ¦®µ¦·
¤µÃ¦¸
o
ª¥ª·
¸
Lowry method (1951: 265-275) ¨³Î
µn
µµ¦¼
¨º
¸É
650 nm ¤µ
Á¸
¥´
¦µ¢ BSA ¤µ¦µÄ®o
¤¸
ªµ¤Á
o
¤
o
´Ê
Ân
0 – 1.6 mg ¨³¼
¦¼
µ¦Â¥
°Ã¦¸
o
ª¥Á·
SDS-PAGE
µ¦Â¥Ã¦¸
o
ª¥Á·
笢d
ªÁ¦´
椵æµ¢¢e
(gel filtration chromatography)
Î
µµ¦´
´Ê
PEG ¨³µ¦´
´Ê
笼
°¤µn
µ°¨´
¤r
Sephadex-G 100 ¸É
¡¸
Á° 8 Äo
°¨´
¤r
¥µª
60 ¤. åĮo
¤¸
°´
¦µÁ¦È
ª
°µ¦¨³¨µ¥´
¢Á¢°¦r
20 ml/h Î
µÅª´
¦·
¤µÃ¦¸
¨³n
µÂ°·
ª·
¸Ê
°Å¨Á
µ¦®µªµ¤n
°°»
®£¼
¤·
ĵ¦Î
µµ
°Á°Å¤r
ŨÁ
Î
µµ¦«¹
¬µªµ¤°»
®£¼
¤·
Än
ª°»
®£¼
¤·
´Ê
Ân
50 – 80
o
C ¸É
Áª¨µ 60 µ¸
Ã¥«¹
¬µÁ°Å¤r
ŨÁ´Ê
ĵ¦´
®¥µ µ¦´
´Ê
PEG ¨³µ¦´
´Ê
笼
°
µ¦Á¦n
·
·
¦·
¥µ¦µÁ°Á°¦·
¢d
Á´
(tranesterification)
µ¦Á¦n
·
·
¦·
¥µo
ª¥ÁÃ¥ Á·
¤µ¦¨³¨µ¥Â°¨°±°¨r
¨Å°¥n
µo
µÇÄÊÎ
µ¤´
¡º
¸É
Äo
Á}
µ¦´Ê
o
Ã¥
´
n
ªÊÎ
µ¤´
¡º
n
° µ¦¨³¨µ¥Á¤°År
Ã¥ÊÎ
µ®´
Ä°´
¦µn
ª 5:1 Á
¥n
µÁ¡ºÉ
°Ä®o
Á·
·
·
¦·
¥µÁ}
Áª¨µ 15 µ¸
´Ê
·Ê
Įo
Á·
·
·
¦·
¥µÁ}
Áª¨µ 4 ´É
ªÃ¤ (¸É
°»
®£¼
¤·
60
o
C)