การประชุมวิชาการระดับชาติมหาวิทยาลัยทักษิณ 2559 - page 28

27
โดย C = ปริมาณสารในกลุ่มฟีนอลิกทังหมดในสารสกัด (mg/g ของสารสกัด ) c = ความเข้ มข้นของกรดแกลลิกที่ได้จาก
กราฟของสารสกัด (mg/ml) V = ปริ มาตรของสารสกัด (ml) m = น ้าหนักของสารสกัด (g)
4 การหาสารต้านอนุมูลอิสระด้ วยวิธี 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging capacity
ดัดแปลงจากวิธีของ Randhir et al. [11] น้าสารสกัดตัวอย่ าง 100 ไมโครลิตร เติมสารละลาย DPPH เข้ มข้น
60 ไมโครโมลาร์ ลงไป 3.00 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากัน ทิงไว้ในที่ มืด 10 นาที จากนันน้าไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น
517 นาโนเมตร ตัวอย่างควบคุมใช้เอทานอล จ้านวน 100 ไมโครลิตร แทนตัวอย่ างสารสกัด ค่าที่ วัดได้น้าไปค้านวณร้อยละ
ของการยับยั งฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (% inhibition)
% inhibition = [(A517 control - A517 sample) / A517 control] ×100
5 การสกัดหาปริมาณโปรตีนและเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสจากต้นอ่อนดาวเรือง
ต้นอ่ อนดาวเรือง 100 มิลลิกรัม เติม Extraction buffer ซึ่งประกอบด้วยสารละลาย potassium phosphate
buffer pH 7.5 เข้มข้น 0.1 โมลาร์ สารละลาย polyvinylpyrrolidone (PVP) เข้มข้นร้ อยละ 0.5 (น ้าหนั กต่อปริมาตร)
และสารละลาย EDTA เข้มข้น 3.0 มิ ลลิโมลาร์ จ้ านวน 2.00 มิลลิลิตร ท้าการปั่นเหวี่ยงที่ ความเร็ว 15,000 รอบต่อนาที
เป็นเวลา 30 นาที ที่อุ ณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ท้าการเก็บสารละลายส่วนใส พร้อมจดปริมาตรของสารละลายส่วยใส [1]
6 การหาปริมาณโปรตีน
สารสกัดจากต้นอ่อนดาวเรือง 100 ไมโครลิตร เติม Bradford reagent จ้านวน 2.75 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันบ่ม
ไว้ที่อุณหภูมิห้องนาน 10 นาที จากนันวัดค่าการดู ดกลืนแสงที่ 595 นาโนเมตร ค้านวณปริมาณโปรตีนทังหมดโดยใช้
สารละลาย Bovine Serum Albumin (BSA) เป็นสารมาตรฐาน [14]
7 การหากิจกรรมของเอนไซม์เปอร์ออกซิเดส
สารสกัดจากต้นอ่อนดาวเรือง 100 ไมโครลิตร เติ มสารละลายบัฟเฟอร์โซเดียมอะซิเตทเข้มข้น 0.05 โมลาร์ pH
5.4 จ้านวน 2.75 มิลลิลิ ตร เติม O-dianisidine เข้ มข้นร้อยละ 0.50 น ้าหนั กต่อปริมาตร จ้านวน 50 ไมโครลิตร ผสมให้
เข้ากัน เติมสารละลายไฮโดรเปอร์ออกไซด์เข้มข้น 0.1 โมลาร์ จ้ านวน 100 ไมโครลิตร ผสมให้เข้ ากัน วัดค่าการดูดกลื นแสง
ที่ 460 นาโนเมตร บันทึกค่าทุก ๆ 15 วินาที จนครบ 3 นาที สร้างกราฟความสัมพันธ์ระหว่างเวลากั บค่าการดู ดกลืนแสงที่
460 นาโนเมตร แล้วน้าค่าที่ได้มาค้านวณหากิจกรรมของเอนไซม์ เปอร์ออกซิเดสโดยให้ 1 ยูนิต ของเอนไซม์เปอร์ออกซิเดส
มีค่าเท่ากับปริ มาณเอนไซม์ที่ท้าให้ค่าดูดกลืนแสงที่ 460 นาโนเมตร เปลี่ยนไป 0.1 หน่วยต่อนาที [15]
8 การหาปริมาณคลอโรฟิลล์
ดัดแปลงจากวิธีของ Horii et al. [10] ใบจากต้นอ่ อนดาวเรือง 50 มิลลิกรัม เติมเมทานอลเข้ มข้นร้อยละ 100
ปริมาตร 3.00 มิลลิลิตร บ่มไว้ในที่มืดเป็นเวลา 2 ชั่วโมง บดให้ ละเอียดและน้ าไปปั่นเหวี่ยงเพื่ อตกตะกอนที่ 13,000 รอบ
ต่อนาที เป็ นเวลา 10 นาที จากนันน้าสารละลายที่ได้ไปวัดค่าการดูดกลื นแสงที่ 650 นาโนเมตร และที่ 665 นาโนเมตร
โดยใช้เมทานอลเข้มข้นร้ อยละ 100 เป็นตั วเปรียบเทียบ ค้านวณหาปริมาณ คลอโรฟิลล์ เอ คลอโรฟิลล์ บี และปริมาณ
คลอโรฟิลล์ทังหมด ตามสมการการค้านวณดังนี คลอโรฟิลล์ เอ (µg/ml) = (16.5 × A665) – (8.3 × A650) คลอโรฟิ ลล์
บี (µg/ml) = (33.8 × A650) – (12.5 × A665) ปริมาณคลอโรฟิลล์ทังหมด (µg/ml) = (25.8 × A650) – (4.0 × A665)
และเปลี่ยนปริมาณคลอโรฟิลล์ให้อยู่ในหน่วย ไมโครกรัมต่อน ้าหนักใบ โดยค้านวณจาก (µg chlorophyll/mL
methanol) × 3 mL methanol/ g (FW tissue)