full2012.pdf - page 114

5
«¹„¬µ„µ¦‡Š°¥¼n°Š¡¨µ¤·——¸Á°ÈœÁ°¨¼„Ÿ¤Äœ B. subtilis ISW1214
พลาสมิดลูกผสม pHentAI เมื่อถูกนําเข้าสู่ เชื้ อ B. subtilis ISW1214 ด้วยวิธี competent cell transformation
พบว่าได้ทรานส์ฟอร์ แมนท์จํานวน 3 ไอโซเลท คื อ ISW(1), ISW(2), ISW(3) แล้วศึ กษาการคงอยู่ของพลาสมิ ดดังกล่าว
ใน B. subtilis ISW1214 ภายใต้สภาวะที่ไม่มียาปฏิชีวนะพบว่าการคงอยู่ของ pHentAI ใน B. subtilis ISW1214 จะค่อยๆ
ลดลงในแต่ละรุ่ นและสามารถคงอยู่ได้เพียง 6 รุ่น (ภาพที่ 4) และจากการศึกษาความเสถียรของโครงสร้างพลาสมิ ดลูก
ผสมด้วยการสุ่มโคโลนีจากการทํา segregational stability จากอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง LB ที่ มีและไม่ มียาปฏิชีวนะเตตรา
ซัยคลินพบว่ามีการคงอยู่ของยีนภายใต้สภาวะที่มียาปฏิชี วนะ แต่ไม่พบการคงอยู่ของพลาสมิ ดภายใต้สภาวะที่ไม่มียา
ปฏิชี วนะเนื่องจากไม่แสดงแถบดีเอ็นเอเมื่ อตรวจสอบด้วย agarose gel electrophoresis (ภาพที่ 5)
¦» žŸ¨„µ¦ª·‹´¥
เมื่อทําการย้ายชิ้ นยีนแบคเทอริโอซิ น entAI จาก Ent. faecium N15 เข้าสู่ เซลล์เจ้าบ้านด้วยพลาสมิดพาหะ
pHY300PLK ได้พลาสมิดลูกผสมชื่ อ pHentAI ซึ่ งมีการคงอยู่ของยีนเมื่อตัดด้วยเอนไซม์ตัดจําเพาะหรื อด้วยวิธี PCR และ
ตรวจสอบด้วยอะกาโรสเจลอิเล็คโตรโฟรี ซีสทั้งใน E. coli DH5Į และ B. subtilis ISW1214 เมื่อย้าย pHentAI เข้าสู่ เชื้ อ
B. subtilis ISW1214 แสดงการคงอยู่ ของพลาสมิ ดแต่มีการถ่ายทอดพลาสมิดลูกผสมได้เพียง 6 รุ่ น เมื่อเลี้ ยงในสภาวะไม่
มียาปฏิชี วนะ
°£·ž¦µ¥Ÿ¨„µ¦ª·‹´¥
ปัจจุบันแบคเทอริโอซิ นถูกนํามาใช้อย่างกว้างขวางทั้ งทางด้านอุตสาหกรรม ด้านการศึกษาและด้านการแพทย์
เนื่ องจากแบคเทอริโอซิ นเป็ นโปรตีนที่ มีฤทธิ์ ในการยับยั้งแคบและเป็ นพิษกับแบคทีเรี ยที่มีสกุลใกล้เคียงกันและสามารถ
สร้างได้ทั้ งแบคทีเรี ยกลุ่มแกรมลบและแกรมบวก (อรอนงค์ พริ้ งศุลกะ, 2550) เพื่อต้องการพัฒนาสายพันธุ ์แบคทีเรี ย
ดั้ งเดิมที่ไม่มีความสามารถในการผลิตแบคเทอริ โอซิ นให้เป็ นแบคทีเรี ยสายพันธุ์ ใหม่ที่ สามารถผลิตแบคเทอริ โอซินและ
ในการศึ กษาครั้ งนี้ จึงได้เปลี่ยนแปลงพาหะเพื่อการถ่ายยีน (subclone) ผลิตแบคเทอริโอซิ นจาก Ent. faecium N15 เข้าสู่
เชื้อ E. coli DH5Į และ B. subtilis ISW1214 ด้วยพลาสมิดพาหะ pHY300PLK ให้ชื่อว่า pHentAI พลาสมิดลูกผสม
ดังกล่าวสามารถแบ่งตัวเพิ่มจํานวนและมีการแสดงออกของยีนยาปฏิชี วนะเตตราซัยคลินทั้งใน E. coli และ B. subtilis
และเมื่อศึกษาการคงอยู่ ของ pHentAI ใน B. subtilis ISW1214 ภายใต้สภาวะที่ ไม่มียาปฏิชี วนะพบว่าพลาสมิดลูกผสม
ดังกล่าวสามารถคงอยู่ในเซลล์เจ้าบ้านได้เพียง 6 รุ่ นเท่านั้ น เนื่ องจากพลาสมิดลูกชนิ ดนี้ ถูกกดให้มีการแสดงออกและการ
คงอยู่ ภายใต้สภาวะที่มียาปฏิชี วนะ ดังนั้ นในสภาวะที่ไม่มียาปฏิชีวนะอาจทําให้พลาสมิดถูกปลดปล่อยออกนอกเซลล์
copy number จึ งลดลงและจากการศึกษาของ Ghosh และคณะ 2006 รายงานว่าการคงอยู่ของพลาสมิดจะถูกควบคุมโดย
ระบบการแบ่งตัวเพิ่มจํานวนของพลาสมิดเหล่านั้ น ทั้งนี้ พบว่าการสูญหายของพลาสมิดเกิ ดขึ้ นในระหว่างกระบวนการ
แบ่งเซลล์เนื่องจากการกระจายที่ ไม่สมํ่าเสมอรวมถึงมี ปัจจัยที่ส่งผลต่อการคงอยู่ของพลาสมิ ดดังตัวอย่าง เช่ น โครงสร้าง
ของพลาสมิ ด copy number และสภาวะที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเชื้ อ (Remaut และคณะ 1981; Stueber และคณะ 1982) เช่น
เมื่อความเข้มข้นของออกซิ เจนในอาหารเลี้ยงเชื้ อลดลงทําให้การคงอยู่ของ พลาสมิดใน Streptomyces lividans ลดลง
(Wrigley-Jones และคณะ 1993) ซึ่ งให้ผลที่ คล้ายกันเมื่ อทดสอบใน E. coli (Ryan และคณะ1989) และจากรายงานของ
Li และคณะ 1998 พบว่าที่ พีเอชตํ่าจะเพิ่มการคงอยู่ของพลาสมิดใน Yersinia enterocolitisca และจากรายงานการศึกษา
ของ Corchero และคณะ 1998 พบว่าเมื่อเลี้ยงเชื้ อ Lactococcus lactis ในอุ ณหภูมิที่สูงขึ้ นการคงอยู่ของพลาสมิ ดจะลดลง
และนอกจากนี้ พบว่าองค์ประกอบของอาหารเลี้ ยงเชื้อส่ งผลต่อการคงอยู่ของพลาสมิ ดด้วยตัวอย่าง เช่ น อาหารที่ทราบ
องค์ประกอบและปริมาณที่แน่นอนของกลูโคสพบว่ามีการคงอยู่ของพลาสมิดที่สูงกว่าอาหารที่ไม่ทราบองค์ประกอบ
114
การประชุมวิชาการระดับชาติ มหาวิ ทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 22 ประจำปี 2555