full2012.pdf - page 113

4
«¹„¬µ„µ¦‡Š°¥¼n°Š¡¨µ¤·——¸Á°ÈœÁ°¨¼„Ÿ¤Äœ B. subtilis ISW1214
Á¨¸ Ê ¥ŠÁºÊ°Äœ°µ®µ¦Á¨¸Ê ¥ŠÁºÊ°š¸ÉŤn¤¸¥µž’·¸ ªœ³ (non selective pressure)
สุ่ มเลือกทรานส์ ฟอร์ แมนท์ B. subtilis ISW1214 [B. subtilis ISW1214 (pH entAI)] จํานวน 3 โคโลนี มาแยก
เพาะเลี้ ยงในอาหารเลี้ยงเชื้ อเหลว LB ปริมาตร 5 มิลลิลิ ตร ที่มียาปฏิชี วนะเตตราซัยคลิน ความเข้มข้น 15 ไมโครกรัม/
มิลลิลิตร บ่ มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 37 ๐C ในตู ้ เลี้ยงเชื้ อแบบเขย่า (Cocono, Thailand) ที่ความเร็วรอบ 150 รอบต่อนาที เป็ น
เวลา 18-24 ชั่วโมง แล้วถ่ายเชื้ อจากทุกๆหลอดๆละประมาณ 1 loop ลงในอาหารเลี้ ยงเชื้อเหลว LB หลอดใหม่ ที่ไม่มียา
ปฏิชี วนะเตตราซัยคลิน ปริ มาตร 5 มิลลิลิ ตร แล้วบ่มเพาะเชื้อที่สภาวะเดิมเป็ นเชื้ อรุ่ นที่ 1 และถ่ายเชื ้อต่อไปจากรุ่ นที่ 1
จนถึงรุ่ นที่ 30 (ระยะเวลา 30 วัน)
„µ¦«¹„¬µ segregrational stability
แบ่งเชื้อจากทุ กหลอดที่เลี้ ยงในสภาวะ non selective pressure ในแต่ละวัน (วันที่ 0 ถึงวันที่ 30) ปริ มาตร 100
ไมโครลิตรและทําเจือจางแบบ 10 เท่า กระจายสารแขวนลอยเจื อจางเชื้ อลงบนพื้นผิวหน้าอาหารเลี้ ยงเชื้อแข็ง LB ที่มี
หรือไม่ มียาปฏิชี วนะเตตราซัยคลิน บ่มเพาะเชื้ อที่อุณหภูมิ 37 ๐C เป็ นเวลา 18-24 ชั่วโมง แล้วคํานวณหาเปอร์เซ็ นต์ของ
โคโลนีที่ดื ้อยาปฏิ ชีวนะเตตราซัยคลินจากสูตร
„µ¦«¹„¬µ structural stability
สุ่มโคโลนีจากการทํา segregational stability โดยสุ่ ม ISW(1), ISW(2), ISW(3) transformed B. subtilis
ISW1214 ของวันที่ 6 จากอาหารเลี้ ยงเชื้อแข็ง LB ที่มีและไม่ มียาปฏิ ชีวนะเตตราซัยคลินมาทําการสกัดและยืนยันดีเอ็นเอ
โดยวิธี freeze-thaw หรือคืนรู ปในการแช่แข็งหรือการละลายในการแช่ แข็งที่ อุณหภูมิ-20๐ ซโดยมี positive control คือ
entAI ที่มีขนาดดีเอ็นเอ 700 bp แล้วทําการยืนยันพลาสมิ ดดีเอ็นเอด้วยปฏิกิริ ยาลูกโซ่ พอลิเมอเรสโดยใช้ คู่ของไพรเมอร์
และสภาวะในการทําปฏิกิ ริ ยาเช่นเดี ยวกับ (Losteinkit และคณะ, 2001)
Ÿ¨„µ¦ª·‹´¥
„µ¦¦o µŠ¡¨µ¤·—¨¼„Ÿ¤ pHentAI
เมื่ อตัดพลาสมิดดี เอ็นเอ pHY300PLK และ pOrient23 ด้วยเอนไซม์ EcoRI และ XbaI พบว่าได้แถบดีเอ็นเอขนาด
4.87 kb ของ pHY300PLK (Lane 2 ภาพที่ 2) และแถบดีเอ็นเอ 3 ขนาดคือ 5.9, 0.89 และ 0.7 kb ของ pOrient23 (Lane 3
ภาพที่ 2) เชื่อมพลาสมิ ด pHY300PLK และชิ้นยีน entAI ด้วยเอนไซม์ T4 DNA ligase แล้วย้ายสู่ E. coli DH5Į โดยวิธี
heat shock transformation ปรากฏว่าได้ทรานสฟอร์แมนท์ทั้งหมด 2 ไอโซเลท ตั้งชื่อว่า pHentAI(4) และ pHentAI(6)
ตามลําดับและสกัดพลาสมิดลูกผสมจาก E. coli DH5Į (ภาพที่ 3A) ตัดด้วยเอนไซม์ EcoRI และ XbaI เพื่อตรวจสอบ
ความเสถียรของโครงสร้างพลาสมิดลู กผสม (Structural stability) ดังกล่าวพบว่าทั้ง pH entAI(4) และ pHentAI(6) ให้
แถบดี เอ็นเอขนาด 4.87 kb ของ pHY300PLK และ 0.70 kb ของ entAI (Lane 4-5 ภาพที่ 3B)
%Tetracycline resistant colony = จํานวนโคโลนี ที่เจริ ญบนอาหารแข็ง LB ที่มียาปฏิชีวนะ X 100
จํานวนโคโลนี ที่เจริ ญบนจานอาหารแข็ง LBที่ไม่มียาปฏิชีวนะ
113
การประชุมวิชาการระดับชาติ มหาวิ ทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 22 ประจำปี 2555