full2012.pdf - page 112

3
มีการแสดงออกของยีนดื้ อต่อยาปฏิชี วนะเตตราซัยคลินทั้งในเชื้ อ E. coli และ B. subtilis โดยมีวัตถุประสงค์ เพื่อศึกษา
การคงอยู่ของพลาสมิดลูกผสมใน B. subtilis ISW1214 ภายใต้สภาวะที่ไม่มียาปฏิชีวนะเพื่ อประโยชน์ในการนํามาใช้
ปรับปรุ งสายพันธุ์เชื้อ B. subtilis ISW1214 เพื่ อต้องการให้มีการเพิ่มปริ มาณการผลิตแบคเทอริ โอซิ นในระดับที่ สูงขึ้ น
และสามารถนําแบคเทอริ โอซินที่ ได้นี้ ไปใช้ประโยชน์ในด้านต่างๆทั้งทางด้านการศึกษา ทางด้านอุตสาหกรรมหรื อใช้
เป็ นยารักษาโรคต่อไปในอนาคต
ª·›¸ „µ¦ª·‹´¥
Á˜¦¸¥¤¡¨µ¤·——¸Á°ÈœÁ° pHY300PLK ®¦º° pOrient23 ‹µ„ E. coli DH5D —o ª¥»—„´— QiAprep Miniprep Spin
(QIAGEN, Germany)
พลาสมิด pHY300PLK [Tain และคณะ (2007)] (Takara Shuza C., Ltd, Kyoto, Japan) ใช้เป็ น shuttle plasmid
vector ซึ่ งสามารถแบ่งตัวเพิ่มจํานวนและมีการแสดงออกของยีนดื้ อต่อยาปฏิชี วนะเตตราซัยคลินทั้ งในเชื้ อ E. coli และ
B. subtilis (ภาพที่ 1 A) พลาสมิด pOrient23 (Lertcanawanichakul, 2007) เป็ นพลาสมิดลูกผสมที่ สามารถแบ่งตัวเพิ่ม
จํานวนและมี การแสดงออกของยีนดื้อยาอิริ โธรมัยซิ น (Er) ทั้งใน E. coli และ enterococci และใช้พลาสมิดชนิ ดนี้ เป็ น
แหล่งของยีน entAI (0.70 kb) ซึ่ งเป็ นยีนแบคเทอริโอซิ นจาก Ent. faecium N15 (ภาพที่ 1 B)
A B
ภาพที่ 1 แผนที่ยีนของ pHY300PLK (A) และแผนที่ยีนของ pOrient23 (B)
„µ¦šÎ µ subclone
ตัดชิ้นยีน entAI จากพลาสมิด pOrient23 และตัดพลาสมิดพาหะ pHY300PLK ด้วยเอนไซม์ตัดจําเพาะ EcoRI
และ XbaI ตรวจเช็คด้วยการทํา agarose gel electrophoresis จากนั้ นทําการเชื่ อมต่อชิ้นยีน entAI และพลาสมิ ด
pHY300PLK ด้วยเอนไซม์ T4 DNA ligase และทรานส์ฟอร์ มเข้าสู่ B. subtilis ISW1214 ซึ่ งเป็ นเซลล์เจ้าบ้าน (host) ตาม
ด้วยทําการคัดเลือกทรานส์ ฟอร์ แมนท์ที่ สามารถเจริญบนอาหารเลี้ ยงเชื้อแข็ง Luria-Bertani (LB) ที่มียาปฏิชี วนะเตตรา
ซัยคลิน (tetracycline) ความเข้มข้น 15 ไมโครกรัม/มิ ลลิลิตร จากนั้ นนําทรานส์ ฟอร์ แมนท์ที่คัดเลือกได้ไปตรวจสอบยีน
แบคเทอริ โอซิ นด้วยปฏิกิริ ยาลูกโซ่ พอลิเมอเรส
112
การประชุมวิชาการระดับชาติ มหาวิ ทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 22 ประจำปี 2555