การประชุมวิชาการและผลงานวิจัย มหาวิทยาลัยทักษิณ ครั้งที่ 17 2550 - page 131

2. การเตรี ยมอาหารผสม Cecropin D
Cecropin D ซึ่ งมี ลักษณะเปนของเหลวสี น้ําตาล มี กลิ่นคลายน้ําหมักยีสต ไดรับจากบริษั ท Shenzhen
Yipeng Bio Engineering ประเทศจี น นํามาผสมอาหารโดยการฉีดพนลงบนอาหารกุงขาวสําเร็จรูปทางการค าชนิด
จมน้ํา ผสมใหเขากันบนเครื่ องกวนแมเหล็ก (Magnetic stirrer) ให ไดความเขมขนของ Cecropin D ในอาหารกุง
เขมขน 0.5, 1.5 และ 3 ppm ตามลําดับ ผึ่งให แหงแล วเก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ตลอดการทดลอง
3. การศึกษาระดับความเข มขนของ Cecropin D ตอปริ มาณเม็ดเลือดรวมและอัตราการรอดของกุงขาว
วางแผนการทดลองแบบสุ มตลอด (Complete randomized design, CRD) โดยเลี้ยงกุงขาวจํานวน 50 ตัว ใน
ถังไฟเบอรกลาสขนาดความจุ 250 ลิตร บรรจุ น้ําความเค็ม 20 ppt ปริมาณ 100 ลิ ตร แบงการทดลองเป น 4 ชุดการ
ทดลอง ชุดการทดลองละ 3 ซ้ํา ดังนี้ชุดการทดลองที่ 1 เปนชุดควบคุมใหอาหารสําเร็จรูปไม ผสม Cecropin D ชุดการ
ทดลองที่ 2, 3 และ 4 ใหอาหารสําเร็จรูปผสม Cecropin D ที่ ระดับความเขมขน 0.5, 1.5 และ 3 ppm ตามลําดับ โดย
ใหกุงขาวกินวั นละ 4 มื้อ เปนเวลา 3 สั ปดาห หลังจากกุงขาวไดรับอาหารผสม Cecropin D นาน 3 สัปดาห แลวเจาะ
เลือดบริ เวณโคนขาเดินคูที่ 3 ชุดการทดลองละ 10 ตัว เพื่ อนําไปวิเคราะหปริมาณเม็ดเลือดรวม (Total haemocyte
count, THC) ตามวิธี การของกิจการและคณะ (2543) และศึกษาอัตราการรอดโดยการชักนําใหติดเชื้อโดยการฉีด
สารละลายแบคทีเรีย V. harveyi ความเข มขนประมาณ 105 CFU/ml (Challenge test) ในกุงขาวชุดการทดลองละ
10 ตั ว บันทึกอั ตราการรอดภายใน 1 สัปดาห โดยการวิ เคราะหความแปรปรวนแบบแจกแจงทางเดียว (One-way
Analysis of Variance, ANOVA) ทดสอบความแตกตางคาเฉลี่ยของตัวแปรโดยวิธี LSD ใชโปรแกรมสําเร็จรูป SPSS
4. การศึกษาการเปลี่ยนแปลงโครงสร างชุมชนแบคทีเรียในตับและตับออน ลําไสสวนกลาง ลําไสสวนปลายและน้ําที่
ใชเลี้ยงกุงขาวดวยเทคนิค FISH
หลังจากกุงขาวไดรับอาหารผสม Cecropin D นาน 3 สัปดาห เก็บตัวอยางกุงขาวตามวิธีการของกิตติชนม
และคณะ (2549) แล วตรวจสอบแบคทีเรียด วยเทคนิค FISH ดั ดแปลงตามวิธี การของ Amann (1995) ดังนี้นํ าตัวอยาง
1-3 ไมโครลิตร เกลี่ยลงบนสไลดเคลือบเทฟลอนทิ้งให แหงแลวดึงน้ําออกดวยเอทานอล 70, 80 และ 100% ครั้งละ
3 นาที บ มตัวอย างดวยโพรบและ Hybridization buffer (NaCl 0.9M, Tris-HCL 20 mM, SDS 0.01% และ
Formamide ตามชนิดของโพรบ) ที่อุณหภูมิ 46 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่ วโมง ลางออกดวย Wash buffer (Tris-HCL
20mM, SDS 0.01%, และ NaCl ตามชนิดของโพรบ) ที่อุณหภูมิ 48 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที ทิ้ งใหแหงแลวหยด
Anti-fading solution ปดทับดวย Cover glass นําไปตรวจสอบดวยกลองจุลทรรศนแบบ Epifluorescent นับจํ านวน
เทียบกับจํานวนแบคทีเรี ยทั้งหมดที่นั บดวยโพรบ EUBmix ทําใหได จํานวนแบคทีเรียเฉพาะกลุมเทียบเปนสัดสวน
ตอแบคทีเรียทั้งหมด
สํ าหรับการตรวจสอบกลุมแบคทีเรี ยดวยเทคนิ ค FISH ใชโพรบ ALF1b, BET42a และ GAM42a มี
ความจําเพาะกับแบคที เรียคลาส α-Proteobacteria, β-Proteobacteria และ γ-Proteobacteria (Manz et al., 1992)
ตามลํ าดับ โพรบ HGC69a มีความจําเพาะกับแบคทีเรี ยในไฟลัม Actinobacteria (Roller et al., 1994) โพรบ
LGCmix มีความจํ าเพาะกับแบคทีเรียในไฟลัม Fermicute (Meier et al., 1999) และโพรบ CFB560 มีความจําเพาะกับ
แบคทีเรียสวนใหญในไฟลัม Bacteriodetes (Louise et al., 2002) นอกจากนี้ในคลาส γ-Proteobacteria ศึกษาด วย
โพรบ GV มีความจํ าเพาะกับแบคทีเรียในจีนั ส Vibrio spp. (Giuliano et al., 1999)