การประชุมวิชาการระดับชาติมหาวิทยาลัยทักษิณ 2559 - page 107

106
2. วิธีการเพาะเลี้ยงราเอนโดไฟท์ในอาหารเหลวและการสกัดสารจากราเอนโดไฟท์
จั ดกลุ่มราเอนโดไฟท์ทั้ งหมดตามลักษณะทางสัณฐานวิ ทยาและน้ ามาเพาะเลี้ยงในอาหาร PDB ปริ มาตร 300
มิลลิลิตร จ้านวน 3 ฟลาสก์ ต่อเชื้อ 1ไอโซเลท วางไว้ที่ อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 3-4 สัปดาห์ กรองแยกตัวเซลล์และน้้าเลี้ ยงเชื้อ
โดยตัวเซลล์ สกัดด้วย methanol (MeOH) และ ethyl acetate ท้าให้แห้งด้วย anhydrous sodium sulphate (Na2 SO4 )
และ rotary vacuum evaporator ที่อุณหภู มิ 45 ºC จะได้ สารสกัดหยาบส่วน cell ethyl acetate (CE) และ cell
methanol (CM) ส่วนน้้าเลี้ยงเชื้อสกัดด้วย ethyl acetate ท้าให้ แห้งเช่ นเดียวกับเซลล์ จะได้สารสกัดหยาบ broth ethyl
acetate (BE) น้าสารสกั ดหยาบ BE, CM และ CE ละลายด้วย DMSO ให้ได้ ความเข้มข้น 10 mg/ml เพื่อเก็บไว้ เป็น stock
solution ที่อุณหภูมิ -4 ºC
3. เชื้ อทดสอบและการเตรียมเชื้ อทดสอบ
แบคทีเรียแกรมบวก: Staphylococcus aureus ATCC25923 และ methicillin-resistant S. aureus SK1
แบคทีเรียแกรมลบ: Escherichia coli ATCC25922 และ Pseudomonas aeruginosa ATCC27853
Streak เชื้อแบคทีเรียทดสอบ บน Nutrient agar (NA) บ่มที่อุณหภูมิ 35 ºC 18-24 ชั่ วโมง เมื่อครบก้าหนดเขี่ยเชื้อ
3-5 โคโลนี ลงในอาหาร Nutrient Broth (NB) ปริมาตร 2 ml น้าไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 ºC 3-5 ชั่ วโมง ใน shaking incubator
ที่เขย่าความเร็ว150 รอบต่อนาที ปรับความขุ่นให้ ได้ 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/ml) ด้วย 0.85 % sterile normal
saline solution (NSS) จากนั้นน้ามาเจื อจางกับอาหาร Mueller-Hinton Broth (MHB) ในอัตราส่วน 1:200
ยีสต์: Candida albicans ATCC90028 และ Cryptococcus neoformans ATCC90112
Streak เชื้อยีสต์ บนอาหาร Sabouraud’s dextrose agar (SDA) บ่มที่อุณหภูมิ35 องศาเซลเซียส 18-24 ชั่วโมง
ส้ าหรับ C. albicans และบ่ มที่อุ ณหภูมิห้อง 48 ชั่วโมงส้าหรับเชื้ อ C. neoformans เมื่อครบก้าหนดเขี่ยเชื้อ 3-5 โคโลนี ลง
อาหาร Sabouraud’s dextrose Broth (SDB) ปริมาตร 2 ml บ่ มที่อุณหภูมิ 35 ºC เป็น 3-5 ชั่ วโมงส้าหรับเชื้ อ C. albicans
และบ่มที่ 25 ºC เป็นเวลานาน 3-5ชั่วโมง ส้าหรับเชื้ อ C. neoformans ใน shaking incubator ที่เขย่าความเร็ว150 รอบต่อ
นาที น้ามาปรั บความขุ่นให้ได้ 2.0 McFarland ด้วย 0.85 % NSS จากนั้ นน้ามาเจื อจางกับอาหาร SDBในอัตราส่วน 1:20
4. การทดสอบของสารสกัดจากเชื้อราเอนโดไฟท์ด้วยวิธี colorimetric broth microdilution tests [1,2]
ทดสอบฤทธิ์ เบื้องต้นของสารสกัดที่ความเข้นข้น 200 µg/ml
ทดสอบฤทธิ์ของสารสกั ดหยาบที่ความเข้ นข้น 200 µg/ml กับเชื้อจุ ลินทรี ย์ก่ อโรคโดยวิ ธี colorimetric broth
microdilution เตรี ยมสารสกัดหยาบ ให้ได้ความเข้ มข้น 400 µg/ml หยดสารสกั ดปริมาตร 50 ไมโครลิตร ลงใน 96 well
plate จ้านวน 3 หลุ ม และหยดเชื้อทดสอบที่เตรียมไว้ ปริมาตร 50 ไมโครลิ ตร จากนั้นน้าไปบ่มที่อุณหภูมิที่สภาวะเดียวกับการ
เตรี ยมเชื้อทดสอบ หยดสี resazurin ที่เจื อจาง (1:10) ลงในหลุมทดสอบ น้าไปบ่ มต่ อ 2-3 ชั่วโมง อ่านผลการทดสอบโดย
สั งเกตสีของ resazurin (resazurin เป็นสีน้้าเงิน สารสกัดยับยั้งเชื้ อได้; resazurin เป็นสีชมพู สารสกัดไม่สามารถยับยั้งเชื้ อได้)