การประชุมวิชาการระดับชาติมหาวิทยาลัยทักษิณ 2559 - page 99

98
วิธีการวิจัย
ตัวอย่างน้้านมโคดิ บ
เก็บตัวอย่างน้้ านมโคดิบจากฟาร์มเกษตรกรในเขตอ้าเภอกงไกรลาศ จั งหวัดสุโขทัย ใส่ในขวดปลอดเชื้อ จากนั้น
บรรจุตัวอย่างใส่ลงในกล่องน้้าแข็งเพื่อป้องกั นการเจริญเติ บโตของแบคที เรียในระหว่ างเดินทางเพื่อน้าตัวอย่ างกลับมา
วิเคราะห์ที่ห้ องปฏิบัติการ จากนั้ นแบ่งตัวอย่างน้้านมโคดิบปริมาตร 15 มิลลิลิ ตร ใส่หลอดทดลองที่ผ่ านการฆ่าเชื้อแล้ ว
และน้าไปแช่อ่ างควบคุมอุณหภูมิที่ 32°C เป็นระยะเวลาต่างๆ เพื่อเพิ่มระดับจ้านวนแบคที เรียในน้้านม แล้วแบ่งตัวอย่าง
น้้านมโคดิบแต่ละหลอดทดลองมาอย่างละ 1 มิลลิลิตร เพื่อน้ าไปวัดปริมาณแบคที เรียด้วยวิธีมาตรฐาน และตัวอย่างน้้านม
ส่ วนที่เหลือน้ าไปวิเคราะห์ ด้วยเทคนิค NIRS
การตรวจวัดปริ มาณแบคทีเรียปนเปื้อนในน้้านมโคดิบด้วยวิธีมาตรฐาน (Standard Plate Count)
ท้าการวิเคราะห์ตามวิ ธีมาตรฐานของ AOAC (2000) [10] น้าตัวอย่างน้้านม 1 มิลลิลิ ตรที่แบ่ งไว้ ใส่ลงในหลอด
ทดลองที่มีสารละลาย 0.1% peptone ปริมาตร 9 มิลลิลิ ตร เพื่อเจือจางตั วอย่างทีละ 10 เท่า ดูดตัวอย่างที่เจือจางใน
ระดับต่างๆ จ้านวน 1 มิลลิลิ ตร แล้วหยดลงในจานเพาะเชื้อ จากนั้นเทอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผ่านการนึ่ งฆ่าเชื้อที่ 121°C นาน
15 นาที ลงจานเพาะเชื้อที่มีตัวอย่างน้้านม และท้าการ pour plate จนตัวอย่างและอาหารเลี้ยงเชื้ อเป็นเนื้อเดียวกัน
ในทันที และรอให้อาหารแข็ งตัว น้าไปบ่มที่ตู้บ่มเชื้ออุ ณหภูมิ 32°C เป็ นเวลา 48 ชั่วโมง ท้ าการนับจ้านวน colony
forming unit (CFU) แล้ วบันทึกค่าเป็ น log CFU/ml
การเตรียมตัวอย่างน้้านมโคดิ บส้าหรับวัดค่าการดูดกลืนแสงเนียร์อินฟราเรด
งานวิจัยนี้ ได้ท้าการศึกษาผลของรูปแบบตั วอย่างน้้านมโคดิบต่อประสิทธิภาพการท้านายปริมาณแบคทีเรีย โดย
แบ่ งการด้าเนิ นการศึกษาออกเป็ น 2 ส่วนดังนี้
ส่ วนที่ 1 ผลของระดับความเข้มข้นน ้านมต่อประสิ ทธิภาพการท้านายปริ มาณแบคทีเรีย : ท้าการศึกษาโดยใช้
ตัวอย่างน้้านมโคดิบ (100%) เปรียบเทียบกับตัวอย่างน้้านมที่ ผสมกับอาหารเลี้ยงเชื้ อชนิดเหลว (Tryptic soy broth;
Merk KGaA, Germany) ในระดับ 10%, 25% และ 50% ของความเข้มข้นน้้านม น้ามาควบคุมอุณหภูมิที่ 32°C เป็นเวลา
30 นาที ก่อนท้าการวัดค่าการดูดกลื นแสง NIR
ส่ วนที่ 2 ผลของเวลาในการบ่มตัวอย่างน ้ านมต่อประสิ ทธิภาพการท้ านายปริมาณแบคที เรีย : ใช้ตัวอย่างน้้านมโค
ดิบ 10% และ 25% มาท้าการศึ กษาต่อ เนื่องจากเป็นระดับความเข้ มข้นที่ให้ผลการท้านายดี โดยน้ าน้้านมที่ ความเข้มข้น
ดังกล่าวมาบ่ มเป็นระยะเวลารวม 120 นาที และระหว่างการบ่มท้ าการแบ่งตัวอย่างมาวัดค่ าการดูดกลืนแสง NIR ที่
ระยะเวลาบ่ มต่างๆ คือ 30, 60, 90 และ 120 นาที
การสแกนตัวอย่ างด้วยแสงเนี ยร์อินฟราเรดและการวิเคราะห์ข้อมูล
เครื่ องมือที่ใช้ในการศึกษาครั้ งนี้คือเครื่อง multi-purpose analyzer (MPA) FT-NIR spectrometer (Bruker,
Bermen, Germany) ที่ช่ วงเลขคลื่น 12000 ถึง 4000 cm-1 วัดค่าการดูดกลื นแสง NIR ด้วยโหมด transflectance โดย
การน้าตัวอย่างน้้านมแต่ ละรูปแบบปริ มาตร 1 มิลลิลิตร บรรจุลงในเซลล์ ตัวอย่างขนาดเส้นผ่านศู นย์กลาง 2 เซนติเมตร
แล้ววาง aluminum reflector ที่ มีระยะ optical pathlength 0.15 มิ ลลิเมตร ลงในเซลล์ตัวอย่าง เพื่อช่วยสะท้อนแสง
กลับมายังตัว detector ของเครื่อง NIRS
จ้านวนตัวอย่างน้้านมแต่ละรูปแบบส้าหรั บใช้ในการวิเคราะห์ข้อมู ลคือ 75 ตัวอย่าง ท้าการแบ่งตัวอย่างแต่ละ
รู ปแบบออกเป็น 2 กลุ่มคื อ กลุ่มสร้างแบบจ้าลอง (calibration set) จ้านวน 50 ตัวอย่าง และกลุ่มท้านาย (prediction
set) จ้ านวน 25 ตัวอย่ าง (ตารางที่ 1) น้าข้อมูลสเปกตรัมของตัวอย่ างน้้านมความเข้มข้นต่ างๆ และระยะเวลาบ่มต่ างๆ มา
สร้างแบบจ้าลองวิเคราะห์ หาความสัมพั นธ์กั บปริมาณแบคทีเรียด้วยวิธี partial lest squares regression (PLSR) ด้วย
โปรแกรม OPUS เวอร์ ชั่น 7.2 จากนั้ นน้าตัวอย่างกลุ่มท้านายมาทดสอบความแม่ นย้าของแบบจ้ าลอง และคัดเลื อก